Перевод научной статьи "Стандартизация уколов иглами и оценка новых защищающих от вирусов перчаток".

МЕТОДИКА



Перчатки



Использовали три типа перчаток: перчатки G-VIR® - синтетические хирургические пер-чатки без талька (фирма Hutchinson Santé, Франция), содержащие жидкий дезинфектант (чет-вертичные соли аммония и хлоргексидин) внутри микроскопических капель, равномерно рас-пределенных в слое толщиной 500 нм, два типа перчаток, предоставленных Hutchinson Santé, сходных с G-VIR®, но без дезинфектанта внутри, и стандартные латексные хирургические пер-чатки (Dermotact®, Wuhrlin Soplamed, Courbevoie, Франция) одинарной (250 нм) или двойной (500 нм) толщин.



Культуры клеток



Клетки Vero (ECACC № 84113001, ATCC, UK) культивировали на модифицированной по Дюльбекку среде (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Франция) с добавлением L-глутамина, анти-биотиков и 10 %-ной фетальной сыворотки теленка (Gibco, Paiseley, Великобритания). Моно-слои клеток выращивали в термостате (37 °С, 5% СО2). При пересевах первичных культур клет-ки отделяли с помощью 0,1%-ного раствора трипсин/ЭДТА. Среду меняли каждые три дня.



Штамм вируса



Использовали штамм Bey HSV1, культивируемый на клетках Vero. Инфицированные мо-нослои собирали тогда, когда цитопатогенный эффект вируса был выражен у всех клеток. По-сле трех циклов замораживания – оттаивания вирус гомогенизировали и сохраняли до исполь-зования с клеточным детритом в ростовой среде при –74 °С. Инфекционный титр, определяе-мый стандартным методом бляшек, выражали в содержании бляшкообразующих единиц (БОЕ/мл) 7. Во всех экспериментах использовали вирусный раствор с 10 (6) БОЕ/мл, приготав-ливаемый 10-кратным разведением в дефибринированной крови овцы (AES Chemunex, Фран-ция). Титр вируса определяли в начале и в конце экспериментов, и он сохранял стабильность. Один и тот же штамм вируса использовался во всех экспериментах.



Автоматизированный аппарат для уколов



Аппарат состоит из пневматического удерживающего иглу устройства и шприца, смонти-рованных на вертикальном направляющем устройстве, позволяющем производить точную ус-тановку глубины укола. Давление воздуха контролируется манометром; скорость укола можно изменять, регулируя воздушный поток.

Из тыльного слоя перчатки вырезали квадраты 8 х 8 см, которые закрепляли на жесткой рамке для контроля растяжения. Угол между иглой и образцом устанавливали в 90° или 45°, располагая образец горизонтально или под углом 45° по отношению к игле. Время пребывания иглы в среде инфектанта было не более 0,5 сек.



Тест с уколами



Полые иглы (MicroLance, Becton Dickinson, Fraga (Huesca), Испания) и катетеры Jelico, Medex, Haslingden, Великобритания) от 25G до 16G прикрепляли к шприцу вместимостью 1 мл (Terumo Europe, Leuven, Бельгия) погружали на 2 см в вирусную суспензию. Кровь засасывали через иглу в шприц и выливали, оставляя каплю крови на кончике иглы, после чего шприц за-крепляли на аппарате для уколов.

Образцы перчаток прокалывали с заданными скоростью, глубиной и углом, не прилагая силы к поршню шприца. Переносимый объем крови собирали в микропробирку (Eppendorf AG, Hamburg, Германия), заполненную 1,2 мл накопительной среды DMEM. Среда была слегка же-лирована с помощью 4% (по весу) желатина (LPB1 50, Rousselot SAS, Courbevoie, Франция) для ими-тации кожного эффекта и во избежание капиллярного пассивного переноса.

После укола накопительная среда разжижалась при 37°С, после чего ее наносили на сплошной клеточный монослой, культивируемый в 60-мм чашке для культур тканей (Becton Dickinson). После двухчасовой инкубации (37°С, 5% СО2) к культуральной среде добавляли 1% человеческой сыворотки (Sigma) и инкубировали 3 дня, после чего проводили визуальный под-счет бляшек.

Для каждого условия эксперимента проводили по 15 уколов (по одному на микропробир-ку), используя для каждого укола новую иглу.



Калибровочная кривая объем/БОЕ



С целью установления соответствия количества бляшек и переносимого объема была по-строена калибровочная кривая, учитывающая клеточную реакцию в присутствии желатина и крови.

1 мкл желированной накопительной среды, содержащей 0,2 мкл вирусной суспензии в крови наносили на клеточный монослой для подсчета бляшек в ряду разведений от исходной вирусной суспензии в крови (титры от 105 до 5 х 106 БОЕ/мл). Затем число бляшек регистриро-валось и сопоставлялось с количеством внесенных вирусов.



Данные анализов



Для каждого исследуемого параметра проводилось по три раздельных эксперимента. Средние значения по 45 полученным данным обрабатывали и выражали в 99,5%-ном довери-тельном интервале с использованием t-критерия Стьюдента. Для определения оказывающих значительное влияние на объем крови параметров различия средних оценивали с помощью про-граммы анализа вариабельности ANOVA с использованием Statgraphics Plus (v5.1, Manugistics, Inc., Rockville, США). Уровень достоверности приняли P< 0.05. Если результаты представляли особый интерес, применялся регрессионный анализ.